El primer embajador de España en la Corte imperial de Praga fue Francisco Hurtado de Mendoza, conde de Monteagudo y marqués de Almazán. Su carrera profesional en la capital del Reino de Bohemia comenzó en 1564 y finalizó catorce años más tarde.
Inmediatamente después, en el año 1578, el cargo de embajador comenzó a ejercerlo el humanista español, Don Juan de Borja, quien editó en Praga su libro "Empresas Morales", del que las Bibliotecas Nacionales de Praga y Madrid atesoran varios ejemplares.

uan de Borja financió asimismo la edición española del libro del licenciado Pedro de Cornejo sobre las guerras habidas en los Países Bajos.
El sucesor de Borja, el catalán Don Guillén de San Clemente vivió en Praga desde 1581 hasta su muerte en 1608. Fue sepultado en la Iglesia de Santo Tomás, sitaen la Ciudad Pequeña de Praga, en un sepulcro que originalmente el embajador había mandado construir para los súbditos de los reyes de España. Su gran biblioteca la legó al Colegio Mayor que la Compañía de Jesús tenía en Praga.

Don Guillén de San Clemente se afamó en Praga como propagador del pensamiento del famoso filósofo catalán del siglo XIII, Ramón Llull (juj), del que se consideraba seguidor. Gracias a esta iniciativa suya, con el lulismo pudo familiarizarse también el célebre pedagogo checo, Juan Amos Comenio.
San Clemente San Clemente

Sin embargo, Don Guillén también era partidario de las ideas del hereje italiano Giordano Bruno, y se destacó como coleccionista y mecenas de las artes y promotor de las nuevas corrientes filosóficas. Praga nunca llegó a gustarle mucho y sus 21 años de estancia en la capital checa los pasó añorando regresar a España, pero en vano. Parte de los motivos de ese descontento eran sus permanentes controversias con el rey de Bohemia y emperador Rodolfo II, de Habsburgo, quien se interesaba más por las artes que por la política europea y la defensa de la fe católica.

Mientras que los embajadores Juan de Borja y de San Clemente se interesaban principalmente por los asuntos centroeuropeos, las actividades oposicionistas de los estamentos checos y las relaciones con Turquía, los diplomáticos españoles que los sucedieron en el siglo XVII concebían el desarrollo del el Reino de Bohemia en el contexto del desarrollo eurooccidental.

A causa de la rebelión de las provincias holandesas, Madrid optó por el fortalecimiento de la cooperación entre los Habsburgo de Bohemia y España. De llevar a cabo esta política en Praga fue encargado el embajador y conde de Monterrey, Baltasar de Zúñiga, quien ejerció ese cargo de 1608 a 1617. El diplomático español, dando muestras de clarividencia, vaticinó que se avecinaba un enfrentamiento centroeuropeo con la Corte de los Habsburgo,cuya sede había sido trasladada de Praga a Viena después de la muerte del emperador Rodolfo II.
Juan de Borja Juan de Borja

Sin embargo, de trascendental importancia para la historia checa fueron las actividades diplomáticas de Iñigo Vélez de Guevara y Tasis, Conde de Oñate, quien defendió los intereses españoles en Bohemia y Austria de 1617 a 1624. Los historiadores sostienen que fue precisamente la influencia diplomática del conde de Oñate la que decidió la derrota de los estamentos protestantes checos, en 1620, y la continuidad de la Casa de Austria en el Reino de Bohemia, cuyo poder duraría casi cuatro siglos.